WIWAM植物表型平臺：不同生長條件擬南芥葉片研究

WIWAM植物表型成像系統(tǒng)由比利時SMO公司與Ghent大學VIB研究所研制生產(chǎn)，整合了LED植物智能培養(yǎng)、自動 化控制系統(tǒng)、葉綠素熒光成像測量分析、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、植物多光譜分 析、植物CT斷層掃描分析、自動條碼識別管理、RGB真彩3D成像等多項*技術(shù)，以較優(yōu)化的方式實現(xiàn)大量植物樣 品——從擬南芥、玉米到各種其它植物的生理生態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)成像分析，用于高通量植物表型成像分析測量、植 物脅迫響應(yīng)成像分析測量、植物生長分析測量、生態(tài)毒理學研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

室內(nèi)植物表型成像系統(tǒng)WIWAM Line

不同生長條件下擬南芥GRF3類轉(zhuǎn)錄因子促進葉片的顯著增長

作物產(chǎn)量的增加對于確保糧食安全以滿足不斷增長的全球需求至關(guān)重要。一些基因修飾可以增加器官的大小，從而提高作物產(chǎn)量。盡管如此，只有在少數(shù)情況下，在脅迫條件下對其性能進行了評估。MicroRNA miR396抑制生長調(diào)節(jié)因子（GRF）基因的表達，GRF基因編碼促進器官生長的轉(zhuǎn)錄因子。本文表面擬南芥At-GRF2和At-GRF3抗miR396活性基因（rGRF2和rGRF3）都增加了器官大小，但只有rGRF3可以產(chǎn)生這種效應(yīng)而不會造成形態(tài)學缺陷。此外在甘藍中引入At-rGRF3可以增加器官的大小，而在擬南芥中引入大豆和水稻的At-rGRF3同源物也會增加葉片的大小。這表明miR396對GRF3活性的調(diào)節(jié)對于許多物種的器官生長是重要的。在干旱脅迫下，含有rGRF3的植物也有較大的葉片，這一條件刺激了miR396的積累。這些植物還表現(xiàn)出對毒力細菌的抗性增強，這表明rGRF3促進的大小增加在植物防御上沒有明顯的成本。我們的研究結(jié)果表明，rGRF3可以在正常和脅迫條件下增加植物器官的大小，是一種有價值的生物技術(shù)應(yīng)用工具。

圖1.miRNA miR 396對GFR轉(zhuǎn)錄因子的廣泛控制

在擬南芥中有九個GRF（圖1a，b），其中七個GRF的miR396靶位位于編碼WRC結(jié)構(gòu)域羧基端的區(qū)域（圖1b，c）。miRNA靶點在不同的GRF中是相同的，但位置8處除外，其中GRF 1-4中有一個C，GRF 7-8中有一個a，GRF9中有一個U（圖1c）。該可變堿基相對于miRNA位于凸起位置，因此對于所有轉(zhuǎn)錄因子而言，與miRNA的相互作用非常相似，然而，WRC結(jié)構(gòu)域羧基端的編碼氨基酸序列不同（圖1c）。有趣的是，擬南芥GRF基因結(jié)構(gòu)顯示外顯子-內(nèi)含子組織和定義該家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分布的差異（圖1b）。我們分析了不同被子植物GRF中miRNA靶點的出現(xiàn)情況（圖1d）。在許多物種中，如毛果楊、大豆和截形苜蓿，所有GRF都有一個miR396結(jié)合位點（圖1d），而在其他物種中，如擬南芥和水稻，一些基因缺少該序列。有趣的是，在擬南芥GRF5中有一個與miRNA靶點非常相似的序列，這是該物種中缺少miR396調(diào)控的兩個GRF之一（圖1c）。這些發(fā)現(xiàn)表明miR396廣泛分布GRF調(diào)節(jié)，并提示這可能是這些轉(zhuǎn)錄因子在被子植物中的默認狀態(tài)。

圖2.與rGRF2相比，rGRF3 在增加葉片尺寸方面的能力更強

分析了大約30株含有rGRF2 或 rGRF3的初級轉(zhuǎn)基因植物（圖2a，b），它們從它們自己的啟動子中表達出來。盡管兩種構(gòu)建體都能夠增加葉面積，但由 rGRF3引起的效果顯著高于使用 rGRF2 獲得的效果。然后我們選擇了rGRF2和rGRF3 純合T3轉(zhuǎn)基因系并確定了GRF 轉(zhuǎn)錄水平（圖2d）。我們發(fā)現(xiàn)GRF3表達增加2倍足以改變70%的葉面積，而GRF2 轉(zhuǎn)錄本增加25倍以上需要引起器官大小的類似增加（圖 2d，e）. 在這兩種情況下，器官大小的增加是由于細胞數(shù)量的類似增加，細胞大小沒有明顯變化（圖2e、f 和 g）。

對rGRF2植物的進一步分析表明，葉片具有形態(tài)缺陷，包括長而扭曲的葉柄，葉片向下卷曲（圖2c）。另一方面，rGRF3植株除了葉面積增加外沒有觀察到明顯的形態(tài)變化。我們認為增加葉片尺寸所需的高水平GRF2也會導致植物發(fā)育中的額外形態(tài)缺陷。 為了確認啟動子不是rGRF2和rGRF3之間觀察到的差異的原因，我們從GRF3啟動子中表達了rGRF2 和 rGRF3，并觀察到pGRF3:rGRF3比pGRF3:rGRF2引起更大的葉面積增加（圖 2h）. 因此，表達水平和GRF蛋白序列都應(yīng)被視為有效增強植物器官大小。如圖所示，雖然兩種rGRF均可用于增加器官大小，但rGRF3是植物器官大小的更活躍和特異性增強劑。

圖3.rGRF3樣基因增加異源物種的器官大小

本文分析了來自rice6和soybean8的GRF轉(zhuǎn)錄因子序列數(shù)據(jù)庫，并選擇了與At-GRF3最相似的數(shù)據(jù)庫。然后，我們在擬南芥At-GRF3啟動子下表達了大豆和水稻擬南芥GRF3樣編碼序列。由于這兩個基因都有一個miR396靶點，我們引入了同義突變以避免被小RNA識別。我們觀察到由大豆和水稻rGRF3樣轉(zhuǎn)錄因子引起的葉片大小增加（圖3a，b）。為了評估rGRF3對其他物種葉片大小的影響，我們在甘藍型油菜轉(zhuǎn)基因植物中表達了轉(zhuǎn)錄因子（圖3e）。對兩個獨立轉(zhuǎn)基因系的分析顯示，葉面積顯著增加20%和32%（圖3c，d）。對轉(zhuǎn)基因葉片的進一步表征表明，葉片大小的增加是由更多的細胞引起的，而不是由細胞大小的影響引起的（圖3c）。對甘藍rGRF3#10植物根系生長的評估表明，這些植物的初生根比對照植物的伸長率更高（圖3h，i）。此外，這些植物的種子大小也增加了10%（圖3f，g）。綜上所述，這些結(jié)果表明，當與miR396調(diào)控脫鉤時，來自不同物種的AtGRF3樣序列有力地增加了幾個器官的大小，包括葉、根和種子。

圖4.miR396-GRF系統(tǒng)對干旱脅迫的響應(yīng)

干旱脅迫是一種相當復雜的情況，根據(jù)脅迫的大小和植物的發(fā)育階段會觸發(fā)不同的反應(yīng)途徑。特別是，水限制條件抑制發(fā)育中器官的細胞增殖和擴張和/或在成熟器官中誘導一系列復雜的耐受和存活反應(yīng)。在田間條件下，有限的水供應(yīng)通常會降低植物生長、生物量積累，從而降低種子產(chǎn)量。使用自動表型分析平臺 WIWAM評估了植物對適度干旱脅迫的反應(yīng)，包括土壤含水量減少。在這些條件下，用空載體轉(zhuǎn)化的對照植物的蓮座面積減少了40%（圖 4a），葉1面積減少了35%（圖4f）。

使用轉(zhuǎn)錄報告基因 MIR396B:GUS 觀察了 MIR396B 的表達，這使我們能夠監(jiān)測葉子中的 miR396 編碼基因的表達。播種后第 11 天 (DAS) 在澆水良好的盆中 MIR396B 在葉片 3 的近端以低水平表達，即仍處于增殖狀態(tài)（圖4b）。 MIR396B:GUS 的最高表達出現(xiàn)在葉的遠端區(qū)域，在該區(qū)域中細胞退出細胞周期。當植物受到輕度干旱脅迫時，葉片尺寸減小，并且在更大的遠端葉區(qū)域中檢測到 MIR396B:GUS 表達，并且染色更強烈（圖4b、c）。因此，小RNA 印跡顯示，受脅迫植物的發(fā)育葉片中成熟 miR396 水平增加了 70%（圖4d）。相比之下，At-GRF3 轉(zhuǎn)錄水平降低了約 60%（圖4e）?？傊?，這些結(jié)果表明 miR396 網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)干旱脅迫。然后我們評估了miR396-GRF3 調(diào)控nde在干旱脅迫期間的作用。為此我們首先分析了35S:miR396 植物對輕度干旱脅迫的反應(yīng)，由于miRNA 的過度表達和 GRFs12 的抑制，這些植物的葉子很?。▓D4f）。當對這些植物施加干旱脅迫時，未觀察到器官大小的進一步減?。▓D4f），表明轉(zhuǎn)基因 miR396 過表達掩蓋了源自內(nèi)源性誘導的MIR396B的影響。

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