WIWAM高通量植物表型成像系統(tǒng)—擬南芥和玉米轉(zhuǎn)基因品系的功能分析

保守的聚（ADP-核糖基）化(PAR)途徑由三個遺傳成分組成，它們是調(diào)節(jié)植物在脅迫下的能量穩(wěn)態(tài)的潛在目標(biāo)，目的是提高作物的產(chǎn)量穩(wěn)定性并幫助確保糧食供應(yīng)。我們通過在擬南芥和玉米 (Zea mays) 中使用轉(zhuǎn)基因方法研究了PAR途徑組分ADP-核糖/NADH 焦磷酸水解酶 (AtNUDX7) 在產(chǎn)量和輕度干旱脅迫中的作用。擬南芥AtNUDX7 cDNA分別通過花椰菜花葉病毒35S啟動子和強(qiáng)啟動子Brachypodium distachyon pBdEF1a在擬南芥和玉米中過表達(dá)。AtNUDX7在擬南芥中的過度表達(dá)改善了通過一種新的自動化方法測量的種子參數(shù)，加速了開花并降低了花序高度。這種有益特性的組合表明，擬南芥中的 AtNUDX7 過表達(dá)可能會通過在聚（ADP-核糖基）化能量穩(wěn)態(tài)途徑中提供 ATP 源來增強(qiáng) ADP-核糖再循環(huán)步驟并維持能量水平。在自動化平臺上分析了 AtNUDX7 基因高、中和低過表達(dá)水平的擬南芥和玉米品系，并在輕度干旱脅迫條件下確定了幾個生長參數(shù)的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示，擬南芥AtNUDX7基因在擬南芥和玉米中不同水平的組成性過表達(dá)并沒有提高對輕度干旱脅迫的耐受性，但下調(diào)AtNUDX7的表達(dá)確實(shí)提高了耐性，但在正常條件下以犧牲一般生長為代價。

AtNUDX7 基因 (AT4G12720) 的全長 cDNA 在組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子控制下使用植物網(wǎng)關(guān)表達(dá)載體pK2GW7在擬南芥哥倫比亞 (Col-0) 種質(zhì)中過表達(dá)，其攜帶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II (nptII) 選擇標(biāo)記基因（圖1A）?；ńD(zhuǎn)化后，在含卡那霉素的培養(yǎng)基上以高密度平板選擇 T0 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，隨后鑒定出具有單基因座純合 T-DNA 插入的 T3 品系。p35S::AtNUDX7 系和 Col-0 對照植物的兩周大T3幼苗用于定量 (q) PCR 表達(dá)分析。與 Col-0 對照相比，在 10 個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因 p35S::AtNUDX7 系中觀察到 AtNUDX7 的高、中和低過表達(dá)水平，范圍在 2 倍到 50 倍之間（圖1B）。我們將其命名為 Atnudx7-1 (SALK-046441) 的功能喪失突變株系，在 Col-0 背景中在 AtNUDX7 基因的外顯子 1 中插入了 T-DNA，驗(yàn)證了其 T-DNA 插入位置，純合 T-DNA 插入，AtNUDX7 基因表達(dá)，并用作陰性對照（圖 1C）。：種子產(chǎn)量；開花時間；水分虧缺；輕度干旱脅迫；組成型啟動子。

圖1.AtNUDX7在擬南芥和玉米中的過表達(dá)

研究了兩個高過表達(dá)(OE) 系 AtNUDX7_OE-At1 和 AtNUDX7_OE-At2、中等OE系A(chǔ)tNUDX7_OE-At3、低OE系A(chǔ)tNUDX7_OE-At5、Atnudx7-1 突變系（Salk -046441_1) 和 Col-0 控制線。呈現(xiàn)并總結(jié)了為p35S::AtNUDX7 OE 系、Atnudx7-1 突變系和 Col-0 對照系確定的種子產(chǎn)量和產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)（圖2,3）。與 Col-0 相比，高OE品系A(chǔ)tNUDX7_OEAt2 每株植物的總種子重量顯著增加，每 10 個長角果的種子數(shù)（種子數(shù)）顯著增加，種子質(zhì)量和大小與 Col-0 相當(dāng)。在中等 OE 品系 AtNUDX7_OE-At3 中可以看到種子數(shù)量、種子大小和每粒種子質(zhì)量的顯著增加，但在總種子重量中沒有。通過稱重*成熟和干燥時收獲的總種子來確定總種子重量，而成像用于確定種子數(shù)量和種子大小。如(材料和方法)所述計(jì)算每粒種子的質(zhì)量。盡管 AtNUDX7_OE-At3 中的種子數(shù)量、種子大小和每粒種子的質(zhì)量有所增加，但獲取種子參數(shù)的方法的差異可能是總種子重量沒有增加的原因。在低 OE 系 AtNUDX7_OE-At5 中，每株植物的總種子重量也顯著增加，而種子數(shù)、種子大小和每粒種子質(zhì)量保持不變（圖2和3）。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，在相同的三個AtNUDX7 OE_At2、AtNUDX7 OE_At3 和 AtNUDX7 OE_At5 品系中測量了改進(jìn)的種子產(chǎn)量參數(shù)，但在高和中OE品系中比在低OE品系中更顯著。

圖2.T3 p35S::AtNUDX7 擬南芥過表達(dá)系、Atnudx7-1突變系(SALK-046441_1) 和Col-0系的種子產(chǎn)量和開花時間參數(shù)

圖3. 四個T3 p35S:AtNUDX7過表達(dá)系和AtNUDX7-1突變系種子產(chǎn)量和開花時間參數(shù)的熱圖

圖4.在輕度干旱脅迫實(shí)驗(yàn)中測量的終點(diǎn)參數(shù)，以比較純合pBdEF1a::AtNUDX7 過表達(dá) T3 玉米品系、AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2 和 AtNUDX7_OEZm3 與 B104 對照玉米在充足澆水和缺水條件下

每天測量第4片葉子的長度，從植物的基部到葉尖，從外觀到成熟，并用于確定葉子的生長速率。當(dāng)?shù)?片葉片停止生長時，測量其葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度、總?cè)~面積以及幼苗的鮮重和干重。分析了三個T3純合玉米系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2和AtNUDX7_OE-Zm3，分別具有AtNUDX7基因的高、中、低過表達(dá)水平，以及B104對照系。水分虧缺時，高表達(dá)和低表達(dá)玉米系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm1和AtNUDX7_OE-Zm3在所有測量參數(shù)中的減少百分比均高于B104野生型，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，在水分虧缺條件下中等過表達(dá)系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm2的葉片4葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度和總?cè)~面積比B104對照組分別減少15%、16%、9%和15%（圖4），而AtNUDX7_OE-Zm2品系在水分虧缺條件下的植物生物量和植物干重減少與B104玉米對照沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。此外，水分虧缺處理后，三個AtNUDX7過表達(dá)玉米系的葉4生長減少百分比與B104對照沒有顯著差異。在自動化平臺上進(jìn)行了三次重復(fù)的缺水試驗(yàn)；在前兩個實(shí)驗(yàn)中，每個基因型的個體較少，大多數(shù)參數(shù)與B104玉米對照沒有顯著差異。