利用Plantarray植物生理表型平臺研究干旱脅迫下黑松的轉(zhuǎn)錄組分析

Transcriptome analysis of Pinus halepensis under drought stress and during recovery

干旱脅迫下黑松恢復(fù)期的轉(zhuǎn)錄組分析

林木利用各種策略來應(yīng)對干旱脅迫，這些策略涉及復(fù)雜的分子機(jī)制。黑松分布于整個地中海盆地，是最耐旱的松種之一。為了破譯黑松用來抵御干旱的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了大規(guī)模的生理和轉(zhuǎn)錄組分析。本文從一個生長條件不理想的半干旱地區(qū)選擇了一棵成熟的樹木進(jìn)行扦插繁殖。然后使用高通量實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測整個植物的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和VPD。在氣孔前反應(yīng)、部分氣孔關(guān)閉、最小蒸騰、灌水后、部分恢復(fù)和*恢復(fù)六個生理階段對植物的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢測。在每個階段，將暴露于干旱處理的植物的數(shù)據(jù)與從灌溉良好的對照植物收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。干旱脅迫下的黑松轉(zhuǎn)錄組是使用雙端 RNA-seq 創(chuàng)建的。在經(jīng)過干旱處理的樹木和對照樹木之間，總共鑒定出約6000個差異表達(dá)的非冗余轉(zhuǎn)錄本。聚類分析揭示了與光合作用、活性氧 (ROS) 通過抗壞血酸 (AsA) 循環(huán)清除、脂肪酸和細(xì)胞壁生物合成、氣孔活性以及類黃酮和萜類化合物的生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物的應(yīng)激誘導(dǎo)下調(diào)。上調(diào)的過程包括葉綠素降解、通過AsA非依賴性硫醇介導(dǎo)的途徑清除活性氧、脫落酸反應(yīng)和熱休克蛋白、thaumatin和exordium的積累。干旱恢復(fù)誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)轉(zhuǎn)座子1-94。干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄組闡明了該物種對干旱和恢復(fù)的動態(tài)反應(yīng)，并揭示了新的機(jī)制。

圖1.干旱和恢復(fù)過程中黑松全株蒸騰速率和冠層氣孔導(dǎo)度的變化

本文評估了在不同灌溉制度下生長的植物的生理反應(yīng)。最初，對植物進(jìn)行7天的充分灌溉，然后暫停灌溉46天，以施加越來越大的脅迫壓力，然后恢復(fù)灌溉。監(jiān)測兩個主要參數(shù)以確定干旱嚴(yán)重程度：中午的E和中午的gsc。與停止灌溉19天后的對照植物相比，干旱處理導(dǎo)致第26天中午E和gsc顯著減少（圖1）。盡管圖1B中的E是五個重復(fù)的平均值，圖1C中的gsc是單個植物的，但在整個實(shí)驗(yàn)過程中E的模式與gsc的模式匹配，并且這兩個參數(shù)與VPD的每日變化相關(guān)（圖1）。隨著干旱的持續(xù)，干旱處理的樹木的gsc從第21天的319逐漸下降到第26天的171，并在干旱期結(jié)束時降至94 mmol s-1 g-1（圖1C）?；謴?fù)灌溉后，經(jīng)干旱處理的樹木的E和gsc恢復(fù)到干旱處理前記錄的水平，表明干旱處理并非結(jié)束。在gsc的基礎(chǔ)上，選擇了兩株干旱處理和兩株灌溉（對照）樹木，在六個不同生理階段進(jìn)行分子研究。選擇的轉(zhuǎn)錄組分析階段（圖1C）如下：（D1）第 21 天的氣孔前反應(yīng)，319 gsc；(D2) 第27天氣孔部分關(guān)閉，171gsc；(D3) 第 53 天的最小蒸騰作用，94 gsc；(D4) 在第54天用116gsc 灌溉后；(D5) 在第56天部分恢復(fù)，271gsc； (D6) 在第69天*恢復(fù)，gsc為523mmol s-1g-1。

圖2.響應(yīng)干旱和恢復(fù)的差異表達(dá)（DE）轉(zhuǎn)錄本

在上述六個生理階段對干旱處理和對照樹木的基因表達(dá)譜分析使我們能夠分析在干旱處理植物和對照植物之間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（圖2）。一般來說，隨著干旱的進(jìn)展，DE轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量逐漸增加，在恢復(fù)過程中逐漸減少。轉(zhuǎn)錄下調(diào)在干旱響應(yīng)中占主導(dǎo)地位，而在重新澆水和整個恢復(fù)期間，轉(zhuǎn)錄上調(diào)占主導(dǎo)地位（圖2）。在 D1 階段的干旱處理和對照克隆中僅鑒定出 27 個上調(diào)和 27 個下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。與在 D2 階段收集的生理數(shù)據(jù)一致，此時注意到 gsc 減少（圖2B），223個轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而370個轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。在D3階段，在觀察到的蒸騰速率和gsc時（圖1B和3B），注意到878個轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)和1490個轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)。再澆水幾個小時后，在D4階段，2071個轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而1505個轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。這些數(shù)字在D5階段（部分恢復(fù)）減少到537個上調(diào)轉(zhuǎn)錄本和510個下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量在 D6 階段（*恢復(fù)）急劇增加至1275，而此時下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量已下降至336（圖 2A）?？偣舶l(fā)現(xiàn)黑松轉(zhuǎn)錄組包含 6035個DE轉(zhuǎn)錄本，其中2466個先前報道過，3567個是從頭組裝的。轉(zhuǎn)錄組包括1035 (17%) 個無注釋的重疊群和 650 (10.1%) 個與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件相關(guān)的重疊群。為了識別不同生理階段常見的轉(zhuǎn)錄本，分別為D2-D6階段的上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本生成了兩個維恩圖（圖2C和D）。下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的最高重疊在階段D3和D4之間，這表明 >50% 的常見轉(zhuǎn)錄本表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。上調(diào)轉(zhuǎn)錄物的最高重疊D4和D6之間，其中大多數(shù)是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的第二高重疊在D3和D4之間，表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。

圖3.干旱和恢復(fù)期間黑松中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)模式

集群20主要由在D4和D6階段上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主導(dǎo)。該集群包括1405個轉(zhuǎn)錄本，其中646個轉(zhuǎn)錄本沒有注釋。該集群還包括與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的489個轉(zhuǎn)錄本。這些誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子屬于HAT、Ty1、Ty3 和Tf2家族（圖6）。然而，具有243個相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的最主要的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是1-94（圖6B 和C）。在該簇的其余275個轉(zhuǎn)錄本中，8個是TF，44個與光合作用相關(guān)，22個過氧化物酶-64轉(zhuǎn)錄本，18個核糖核酸酶 (RNase) H轉(zhuǎn)錄本和10個內(nèi)切核糖核酸酶切丁酶轉(zhuǎn)錄本。在簇6和27中看到了28個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的類似模式，它們總共包括130個轉(zhuǎn)錄本。